Cultivo y aislamiento de microorganismos marinos

Para el estudio de microorganismos marinos sería interesante tomar muestras relativamente grandes y no contaminadas y mantenerlas, en lo posible, a la temperatura y presión originales hasta su traslado al laboratorio a donde se llevarán con la mayor rapidez posible. Muchos microorganismos marinos son lábiles y se pierden con facilidad en cuanto se varían las condiciones habituales de su hábitat (salinidad, temperatura, pH presión, etc). Tampoco se puede perder de vista las alteraciones que con rapidez sufre la comunidad microbiana, tanto en su número como en su variedad y distribución, si las muestras no se conservan adecuadamente. Al alterarse las condiciones del entorno, se produce rápidamente una gran disminución de la flora y un aumento de la concentración total de microorganismos, seguido por una disminución general del número de especies. Una temperatura de 0ºC es ideal para para conservar las muestras sin que sufran grandes alteraciones. Entre 0 y 7ºC pueden conservarse bastante bien durante 24 horas. Temperaturas por encima de 25ºC son perjudiciales para muchos microorganismos marinos.

Para poder cultivar y cuantificar los microorganismos acuáticos, relativamente dispersos en el medio, es necesario concentrar las muestras e incluso, a veces, proceder a fraccionamientos por tamaño. Para esto son de gran utilidad los filtros selectores por tamaño de poro.

Cuando se realiza un recuento directo de células en las muestras hay que tener en cuenta que suele ser siempre superior al que se obtiene sobre cultivos (incluso hasta dos o tres órdenes de magnitud) ya que la gran mayoría de los microorganismos marinos no se encuentran en suspensión en la columna de agua sino adheridos a partículas o incluso a otros microorganismos del plancton y, por otra parte, hay que considerar qué no todos los gérmenes visibles resultan viables. Los métodos clásicos de recuento son variados y pueden realizarse por determinación directa de los microorganismos o de alguno de sus componentes o productos derivados de su metabolismo. Recuento en cámara celular (Neubauer o Thoma), por microscopía óptica convencional (exámenes en fresco o tinciones específicas), microscopía de fluorescencia, determinaciones de productos derivados (ATP, ADN, clorofila, lípidos de membrana, etc)

Con vistas al cultivo convencional, las muestras ya concentradas pueden enriquecerse selectivamente para favorecer el crecimiento de grupos fisiológicos determinados, pero utilizando procedimientos convencionales de enriquecimiento resulta muy complicado aislar micoorganismos con un ritmo de crecimiento propio muy bajo, o con elevada afinidad por un sustrato, por poner un par de ejemplos, ya que son superados y eclipsados por microorganismos comunes de crecimiento más rápido. Y este es uno de los más serios problemas de los medios de cultivo estándar utilizados de rutina en el laboratorio de Microbiología.

Los microorganismos suelen aparecer en la naturaleza formando parte de comunidades mixtas y su atividad metabólica pueda encontrarse en cualquier fase de su ciclo, incluso en estado latente. Ambas situaciones representan una dificultad extra en la ya de por sí compleja tarea de cultivarlos y aislarlos en laboratorio.

Así, para aislar una población determinada de entre una comunidad mixta, o ciertas poblaciones minoritarias que no se desarrollarían frente a otras menos exigentes y de rápido crecimiento que se convertirían en dominantes, es necesario recurrir a enriquecer el cultivo en función de la comunidad que interese recuperar. Este enriquecimiento consiste en variar el entorno nutricional y fisiológico del cultivo para favorecer a dicha población.

Según algunos autores, para conseguir una densidad poblacional adecuada que permita la formación de colonias bien aisladas, el inóculo no debe exceder de 0.1 ml a fin de que el recuento en placa oscile entre 30 y 300 UFC (Unidades Formadoras de Colonias) que sería, según estos autores la cifra ideal. Si se superase este recuento, conviene diluir la muestra original y, en el caso contrario, ante un recuento en placa excesivamente bajo, habría que recurrir a algún sistema de concentración de la muestra (centrifugación y siembra del precipitado o pellet, filtración con membranas de tamaño de poro sobre 0.22 micrometros e inoculación directa del filtro sobre los medios de cultivo, etc).